商品屬性：

描述：本試劑盒所包含的原核表達載體(pCold-SUMO-10His)是在 pCold-SUMO 載體基礎上改造而成，

該載體啟動子(CS Promoter)來源于南極嗜冷細菌，在低溫下(15 度)才能啟動蛋白的表達。低溫下細菌生長緩慢，使得蛋白合成速度減慢，從而最大限度的提高了蛋白正確折疊的幾率，提高了蛋白可溶性表達，增強了活性蛋白的表達比率。該表達系統(tǒng)所包含的 SUMO tag 可以極大地提高小分子量蛋白的表達量，而且進一步提高了蛋白的可溶表達幾率。同時，TEE 信號肽可增強冷啟動子調控下目的蛋白的高表達。
改進后的 pCold-SUMO-10His 載體，其 SUMO 蛋白標簽含有 10 個組氨標簽（10His tag），使其結合 Ni-NTA 的能力更強。與較早版本的 pCold-SUMO 表達系統(tǒng)相比，pCold-SUMO-10His 表達系統(tǒng)在保留了原有統(tǒng)的蛋白可溶性能生產能力、高特異性剪切能力的情況下，對 Ni-NTA 結合能力的得到明顯提高。其對 Ni-NTA 結合能力的提高，

在以下三個方面改善了生產重組蛋白的性能：

（1）提高了粗蛋白樣品中目標蛋白的捕獲能力，從而提高純化產量；

（2）在蛋白純化過程中可以
使用更高濃度的咪唑進行漂洗，去雜蛋白的能力明顯提升，從而獲得更高純度的重組蛋白；

（3）在重組蛋白酶切去除 SUMO標簽后，利用 Ni-NTA 去除 SUMO 標簽更為，獲得純度更高的無標簽目標蛋白。
關于宿主菌的使用：本試劑盒配備了兩種宿主表達菌感受態(tài)細胞，Lyophilized Arctic (DE3)感受態(tài)和 LyophilizedBL21(DE3) Chaprone 感受態(tài)，兩種感受態(tài)均為凍干品形式可長期保存在-20℃，效價無明顯下降（2~10X10e5 cfu/μg）。
通常在質粒載體的構建完成，并測序驗證后，可將重組質粒轉入該感受態(tài)進行蛋白表達。該宿主菌僅為蛋白表達生產用，不可以進行載體構建和質粒的提取制備。由于 pCold-SUMO 系統(tǒng)的高可溶性表達特性，在大多數(shù)情況下重組蛋白在 LyophilizedArctic (DE3)感受態(tài)即可獲得理想的可溶表達，因此實驗請選用 Lyophilized Arctic (DE3)感受態(tài)宿主菌。

在 LyophilizedArctic (DE3)感受態(tài)宿主菌可溶表達效果不理想的情況下，再選用操作相對復雜的、帶有輔助折疊伴侶分子的 LyophilizedBL21(DE3)Chaprone 宿主菌，該系統(tǒng)可獲得最佳的可溶表達。除此外，pCold-SUMO 系統(tǒng)在常規(guī) BL21(DE3)、BL21(DE3)plys等宿主菌內均可獲得可觀的可溶性表達。
關于蛋白酶的使用：試劑盒配備了 SUMO 蛋白酶（酵母來源，也稱為 UIP 蛋白酶）和 rTEV 蛋白酶，在第一步載體構建過程中需要評估、考慮兩個蛋白酶的使用策略。SUMO 蛋白酶識別蛋白結構，切割活性高、酶切，對于需要去除 Tag的重組蛋白其是。個別情況下 SUMO 標簽的結構會受到 C 端重組目標蛋白的影響，使得 SUMO 蛋白酶對重組融合蛋白的切割效率降低、甚至是無效，此時再選用 rTEV 蛋白酶進行酶切。由于 rTEV 蛋白酶識別氨基酸序列，個別重組融合蛋白會包埋識別序列，因此也會導致蛋白酶切效率下降。由于重組融合蛋白結構的無法預測性，因此在實驗過程中兩種蛋白酶的酶切均需要測試。無論如何，通常 SUMO 蛋白酶具有更高的效率。本試劑盒配備的 SUMO 蛋白酶可以識別 SUMO標簽結構（SDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG）切割位點位于 QIGG 之后。SUMO 蛋白酶含有雙 His 標簽，保證了 SUMO 蛋白酶高親力的結合 Ni-NTA，以最大限度的去除 SUMO 蛋白酶（分子量約 26kD）。rTEV 蛋白酶可以識別 SUMO 標簽后面的 Glu-AsnLeu-Tyr-Phe-Gln-Gly (ENLYFQG)氨基酸序列，并在識別位點 Gln-Gly(QG)之間進行切割，從而去除 SUMO 標簽。rTEV 蛋白酶含有 6XHis 標簽（分子量約 30kD），可使用 Ni-NTA 純化介質去除。
本試劑盒配備的 pCold-SUMO-10His-Positive Plasmid 為蛋白表達陽性質粒，該質粒含有 43kD 的目標蛋白，其與SUMO 標簽（19kD）融合后分子量約為 62kD。該表達質粒在 Arctic (DE3)中即可獲得良好的表達。其可以僅可做為表達、酶切實驗的陽性對照品。

PCR基本步驟及注意事項？

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法，它類似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應同樣需要類似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列，實現(xiàn)對特定位置的擴增；PCR Buffer提供一個反應的緩沖環(huán)境；反應過程同生物體內一樣，DNA雙鏈打開，引物結合模板，延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應溫度實現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈，在退火溫度處引物結合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復重復此過程即可實現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環(huán)開始才產生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子，進一步循環(huán)地產生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數(shù)擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續(xù)大量擴增，達到較高水平。因此，應適當調節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺期前結束反應， 減少非特異性產物。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產物，cDNA等，但不能為RNA。對于不同類型的模板，其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠，質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產物預變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結合，合成另一條鏈。從第二輪開始，兩個引物均與特異位點結合，從而實現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增，原因就在于實現(xiàn)PCR反應的是DNA聚合酶，只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說，一般25ul體系DNA的質量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響，故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質粒及PCR產物由于其結構簡單，且提取濃度一般較低，則無需稀釋。

PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準);

2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準確。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實驗設計和目的進行。

1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優(yōu)化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。

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